文 |黛月白

編輯 | 黛月白

引言

近年來(lái)，海底隧道建設(shè)成為了現(xiàn)代交通發(fā)展的重要組成部分，隨著時(shí)間的推移，一些海底隧道的鋼筋噴射混凝土遭受了惡化現(xiàn)象，這引起了研究人員的關(guān)注，更加令人驚訝的是，研究發(fā)現(xiàn)這些惡化的混凝土內(nèi)，蘊(yùn)藏著各種不同的微生物群落。

混凝土生物破壞

混凝土的生物破壞，是由微生物的代謝活動(dòng)引起的，包括細(xì)菌、古菌、真菌和藻類，它導(dǎo)致了混凝土結(jié)構(gòu)和功能的不良變化，開(kāi)裂、剝落、凹坑和混凝土基質(zhì)中化合物的溶出，微生物需要在混凝土表面定居并形成生物膜，這個(gè)過(guò)程被稱為生物污垢。

生物膜提供了多種優(yōu)勢(shì)，易于獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并對(duì)極端環(huán)境和侵蝕性化合物具有抵抗力。

在混凝土表面形成的生物膜中，微生物細(xì)胞，被嵌入在自產(chǎn)生的胞外聚合物物質(zhì)中，生物膜具有高度水化和開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，其中不同微生物群落的菌落之間有空隙，形成微環(huán)境的梯度。

混凝土表面的高粗糙度、孔隙和微裂紋，為生物污垢的形成提供了有利條件，混凝土的pH值在施工后通常較高，對(duì)微生物的定居具有一定的免疫性，但當(dāng)pH值降低到一定程度時(shí)，生物污垢才會(huì)形成，釋放出的生物酸進(jìn)一步降低了混凝土的pH值，最終溶解水泥糊漿基質(zhì)。

僅靠生物酸無(wú)法完全解釋混凝土的全面破壞，更多是由于持續(xù)進(jìn)行的微生物相互作用的影響，降低的pH值還促進(jìn)了鋼筋和纖維的腐蝕，生物膜中的胞外聚合物，進(jìn)一步加速了鋼筋的腐蝕，其中含有負(fù)電荷，促進(jìn)與金屬的離子和靜電結(jié)合，產(chǎn)生了電偶反應(yīng)。

微生物的活動(dòng)導(dǎo)致了混凝土的持續(xù)破壞，混凝土的生物破壞是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不僅涉及生物酸的作用，還包括微生物相互作用和鋼筋腐蝕多個(gè)因素，海底隧道等重要建筑物，科研人員需要采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，以延緩混凝土的生物破壞過(guò)程，確保結(jié)構(gòu)的安全和可持續(xù)發(fā)展。

奧斯陸峽灣海底隧道的微生物群落

研究人員在挪威德羅巴克附近的奧斯陸峽灣海底隧道，進(jìn)行了采樣，這個(gè)隧道長(zhǎng)7,306米，寬11.5米，最大深度為海平面以下134米，巖體主要由花崗片麻巖和偉晶巖組成，其中的節(jié)理和斷層帶含有黏土礦物質(zhì)。

采樣是在三個(gè)不同的隧道位置進(jìn)行的，主隧道、泵站和奧斯陸峽灣試驗(yàn)場(chǎng)地，代表兩種不同的混凝土基材。主隧道和泵站的混凝土噴涂于1999年，用作永久巖體支護(hù)。這些混凝土采用了一種快速硬化水泥，水膠比為0.42。

膠凝劑含量約為514 kg/m^3，添加了5%硅灰，并添加了鋼纖維增強(qiáng)和減水劑。根據(jù)混凝土標(biāo)準(zhǔn)NS EN 206，這些混凝土屬于耐久性等級(jí)M45和強(qiáng)度等級(jí)B45。硫酸鋁被用作凝結(jié)促進(jìn)劑。

奧斯陸峽灣試驗(yàn)場(chǎng)上的混凝土耐久性試驗(yàn)始于2010年3月，不久后就發(fā)現(xiàn)了微生物生物膜，試驗(yàn)場(chǎng)的混凝土基于CEM II/AV 42,5 R，采用不同的配比制備，生物膜采樣站點(diǎn)位于水膠比為0.43、4%硅灰、減水劑。

鋼纖維和聚丙烯纖維制成的噴涂混凝土上，同樣使用硫酸鋁作為凝結(jié)促進(jìn)劑，這種混凝土與其他兩個(gè)位置的混凝土相比，對(duì)應(yīng)于M45和B45，使用飛灰水泥制成的混凝土，被認(rèn)為比基于CEM I的混凝土更耐久。

在評(píng)估水泥糊劑降解和鋼纖維腐蝕的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，使用了NS EN 206的暴露等級(jí)，在所有三個(gè)研究地點(diǎn)和所有混凝土配比中，所使用的等級(jí)為XC2-XC3、XS3和XA3，這些混凝土在這樣的環(huán)境中，被認(rèn)為是耐久的。

需要注意的是，混凝土的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境分類，并未考慮生物膜的影響在泵站中，水的溫度為13°C，在主隧道和測(cè)試點(diǎn)的位置大約為8-9°C，并且在過(guò)去幾年中保持相對(duì)穩(wěn)定，盡管科研人員沒(méi)有測(cè)量與生物膜相關(guān)的水流量，但在所有位置上的主要特征是水的滲透速度較慢。

需要注意的是，從2013年開(kāi)始，泵站的水負(fù)荷在空間和容量上都持續(xù)增加，與此相比，之前的13-14年期間，生物膜主要是由較小區(qū)域中的緩慢滲透水所形成，這段文字描述了對(duì)生物膜樣品和水樣品，進(jìn)行微生物群落分析，以及化學(xué)分析的方法。

采集的生物膜樣品是厚且軟的，使用金屬管取得樣品核心，而薄生物膜則用手術(shù)刀從混凝土上刮下，采樣后，樣品立即在乙醇-干冰混合物中快速冷凍，并在運(yùn)輸過(guò)程中放置在干冰中，并在-80°C下保存，直到進(jìn)行核酸提取。

一部分生物膜樣品還用于化學(xué)分析，水樣品則在無(wú)菌瓶中收集，并在運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室期間放置在干冰中，所有水樣品在分析前均經(jīng)過(guò)0.45微米的過(guò)濾，用于化學(xué)分析的生物膜樣品在分析前經(jīng)過(guò)均質(zhì)化，并在105°C下干燥。

微波消解后，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀以及酸按照EPA 3051協(xié)議對(duì)選擇性金屬進(jìn)行定量分析，生物膜的總固體和揮發(fā)性固體，分別根據(jù)APHA 1998標(biāo)準(zhǔn)方法2490 A-D進(jìn)行分析，水中的氯化物、硝酸鹽、銨鹽和硫酸鹽則根據(jù)FINAS認(rèn)可的方法進(jìn)行分析。

這個(gè)工作流程的目標(biāo)是從生物膜樣本中提取DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，科研人員使用Fast DNA spin kit for soil從500mg的生物膜中提取DNA，這個(gè)試劑盒可以高效地提取DNA，并且適用于土壤樣本。

科研人員使用引物515′F和806 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V4區(qū)域，這一區(qū)域可以涵蓋細(xì)菌和古菌的序列，以便進(jìn)行宏基因組分析，這些引物在先前的研究中已經(jīng)被驗(yàn)證為有效。

PCR擴(kuò)增后，科研人員對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化和歸一化處理，以準(zhǔn)備測(cè)序，科研人員使用Illumina MiSeq和MiSeq試劑盒v2進(jìn)行測(cè)序，Illumina MiSeq是一種高通量測(cè)序平臺(tái)，可以產(chǎn)生大量高質(zhì)量的DNA序列數(shù)據(jù)。

測(cè)序完成后，科研人員使用USEARCH v.10進(jìn)行序列處理和篩選，科研人員使用MiDAS篩選數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行分類，這樣可以將不同的序列與已知的分類進(jìn)行對(duì)比，以確定它們屬于哪些細(xì)菌或古菌。

科研人員對(duì)分類的序列變異體，在這個(gè)研究中，科研人員使用了三個(gè)R包來(lái)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)、多樣性和空模型計(jì)算，以及數(shù)據(jù)可視化，科研人員使用配對(duì)Sorensen和Bray-Curtis差異，來(lái)估計(jì)樣本間的β多樣性，并使用主坐標(biāo)分析將樣本可視化。

科研人員使用置換多元方差分析，來(lái)檢驗(yàn)樣本間β多樣性的差異，在vegan包中，科研人員使用標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)大小，來(lái)估計(jì)配對(duì)Sorensen差異，以測(cè)試樣本間隨機(jī)組成，科研人員使用保持物種豐富度和物種發(fā)生率的空模型，并使用quasiswap算法進(jìn)行999次模擬的空模型群落。

科研人員使用picante包來(lái)計(jì)算未加權(quán)最近分類指數(shù)，并使用“taxa.labels”的空模型，進(jìn)行999次迭代，以測(cè)試密切相關(guān)類群之間的系統(tǒng)發(fā)生聚類，為了探索微生物群落結(jié)構(gòu)與生物膜，以及水的化學(xué)特性之間的關(guān)聯(lián)。

科研人員使用Welch's ANOVA，來(lái)檢驗(yàn)群落豐富度和均勻度的差異，并使用Games-Howell檢驗(yàn)進(jìn)行事后分析，這些分析有助于科研人員理解樣本間的差異和相似性，并從中推斷出關(guān)于微生物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境特征之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)使用微傳感器，對(duì)生物膜進(jìn)行原位氧和pH梯度測(cè)量，氧微傳感器和pH微傳感器與參比電極結(jié)合使用，連接到一個(gè)多用途儀表上，并通過(guò)軟件進(jìn)行控制，在每次測(cè)量之前，先使用一個(gè)已使用過(guò)的微傳感器估計(jì)生物膜的深度。

將微傳感器尖端定位在生物膜-水界面上，并在每次測(cè)量之前等待一段時(shí)間進(jìn)行微剖面測(cè)量，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，根據(jù)制造商的協(xié)議，氧傳感器進(jìn)行了校準(zhǔn)，使用100％空氣飽和鹽水地下水在當(dāng)前溫度下進(jìn)行校準(zhǔn)，而pH傳感器使用當(dāng)前溫度下的三個(gè)pH緩沖液點(diǎn)進(jìn)行線性校準(zhǔn)。

掃描電子顯微鏡，是一種科學(xué)儀器，用于觀察微小的樣品，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，科研人員使用了一臺(tái)名為Hitachi S-4800SEM的儀器，配備了能量散射X射線光譜儀，科研人員將未經(jīng)涂層的手選樣品固定在碳膠帶上，并使用這臺(tái)儀器，對(duì)樣品進(jìn)行了化學(xué)點(diǎn)分析。

對(duì)于大多數(shù)元素，分析精度在1-2%之間，但對(duì)于碳和氮元素，精度相對(duì)較低，科研人員還捕捉了樣品的反射電子圖像，以提供更多的信息，科研人員使用了掃描電子顯微鏡和能量散射X射線光譜儀，來(lái)對(duì)未經(jīng)處理的樣品進(jìn)行化學(xué)分析。

這些實(shí)驗(yàn)幫助科研人員了解樣品的化學(xué)成分，并提供了有關(guān)樣品結(jié)構(gòu)和特性的詳細(xì)信息，測(cè)量結(jié)果表示，奧斯陸峽灣海底隧道的鹽水地下水，與海水的化學(xué)成分相似，它們的主要成分是氯化物、鈉和硫酸鹽，濃度較高。

而銨離子、硝酸鹽和溶解有機(jī)碳的濃度較低，科研人員研究了接觸混凝土和生物膜后的水樣，與僅接觸巖體的水樣相比，科研人員發(fā)現(xiàn)鈣、鎂和釩的濃度更高，對(duì)于其他元素，沒(méi)有明顯的差異。

通過(guò)對(duì)生物膜的化學(xué)分析，科研人員發(fā)現(xiàn)橙色生物膜中，含有較高濃度的鐵和鈣，而黑色生物膜中含有較高濃度的錳，科研人員還通過(guò)失重，測(cè)定確定了生物膜中有機(jī)物的含量，結(jié)果顯示大部分生物膜成分是無(wú)機(jī)物。

根據(jù)16S rRNA SVs的分類分析，科研人員發(fā)現(xiàn)變形菌門是生物膜群落的主要成員，占據(jù)了群落的44-49%，除了變形菌門，大部分SVs屬于隱球菌門、古菌門、擬桿菌門和放線菌門，微酸菌門和硝化螺旋菌門，在64個(gè)生物膜樣本中的相對(duì)序列豐度，超過(guò)了總?cè)郝涞?%。

為了更直觀地了解這些結(jié)果，科研人員繪制了一個(gè)箱線圖，展示了生物膜中前15個(gè)主要門的情況，閱讀量采用對(duì)數(shù)刻度顯示，在箱線圖中，粗體垂直線代表中位數(shù)，箱體邊界代表25%和75%分位數(shù)，排除異常值的水平線代表最小值和最大值，而點(diǎn)表示異常值。

這些分析結(jié)果表明不同的菌門在生物膜群落中，扮演著重要的角色，并且變形菌門是最主要的成員之一，微酸菌門和硝化螺旋菌門，在樣本中的相對(duì)序列豐度也相對(duì)較高，這些信息有助于科研人員更好地了解生物膜的組成，和生態(tài)系統(tǒng)中不同微生物的相對(duì)豐度。

海底隧道鋼筋噴射混凝土中，蘊(yùn)藏的微生物群落，對(duì)于海底隧道的生物破壞，具有重要意義，通過(guò)深入研究和了解這些微生物群落，科研人員可以更好地應(yīng)對(duì)，和解決海底隧道鋼筋噴射混凝土的惡化問(wèn)題，保障隧道的結(jié)構(gòu)完整性和使用安全性。

結(jié)語(yǔ)

通過(guò)深入研究和了解微生物的特性和作用機(jī)制，科研人員可以制定合理有效的預(yù)防和控制策略，保障隧道的結(jié)構(gòu)完整性和使用安全性，這需要工程界、學(xué)術(shù)界和政府部門的共同努力與支持，才能在海底隧道建設(shè)和維護(hù)中取得更大的成功。

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